*****以下內(nèi)容轉(zhuǎn)載至國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心 于2026年5月27日 發(fā)布的公告****

 一、概述

  細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）一般指由細(xì)胞釋放的具有脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的顆粒的統(tǒng)稱，其不具有自我復(fù)制能力。

  近年來，EVs藥物逐漸成為細(xì)胞衍生物類藥物、新型藥物遞送系統(tǒng)等研發(fā)領(lǐng)域的重要方向。

EVs藥物來源多樣（如人源干細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、基因修飾細(xì)胞系等），一般經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、上清收獲、濃縮純化等步驟生產(chǎn)制備，也可裝載核酸、小分子、活性肽、抗體等活性成分或靶向分子。常見的劑型包括注射劑、滴鼻劑、鼻噴劑、滴眼液、外用制劑等。其具有多種活性成分，作用機(jī)制復(fù)雜，不同類型EVs藥物可能存在不同程度的風(fēng)險(xiǎn)。因此，建議申請人基于EVs藥物設(shè)計(jì)和工藝特點(diǎn)，參考相關(guān)指導(dǎo)原則的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理理念，科學(xué)利用風(fēng)險(xiǎn)評估工具，從藥物設(shè)計(jì)、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制和穩(wěn)定性等多方面進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，制定相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)控制策略。

  現(xiàn)階段EVs的藥學(xué)研究技術(shù)仍處于快速發(fā)展階段，研發(fā)與評價(jià)體系亦在持續(xù)探索與完善過程中。本文基于當(dāng)前科學(xué)認(rèn)知、研究實(shí)踐及技術(shù)積累，針對人源細(xì)胞來源的EVs藥物臨床試驗(yàn)階段藥學(xué)研究的共性問題，提出一般性技術(shù)要求，為藥品注冊申請人/上市許可持有人提供參考，對于其他來源或者具有特殊生產(chǎn)工藝的EVs藥物，經(jīng)評估適用可參考本文件。隨著該領(lǐng)域技術(shù)的發(fā)展與審評認(rèn)知積累，相關(guān)內(nèi)容將不斷修訂與更新。對于其他復(fù)雜情形或隨著技術(shù)發(fā)展出現(xiàn)的新情況，鼓勵(lì)藥品注冊申請人/上市許可持有人與審評機(jī)構(gòu)進(jìn)行溝通交流。

二、常見問題與解答

（一）臨床試驗(yàn)樣品的生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)，在建庫、檢定和穩(wěn)定性研究等方面有何技術(shù)要求？

1. 生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的總體要求

  EVs藥物的生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)可來源于原代細(xì)胞及具有細(xì)胞庫體系的細(xì)胞等，其來源應(yīng)合規(guī)，并應(yīng)符合相關(guān)倫理以及生物安全相關(guān)法律法規(guī)要求?？紤]到生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)及其培養(yǎng)體系對 EVs藥物的質(zhì)量可能具有顯著影響，建議從適應(yīng)癥、產(chǎn)品特點(diǎn)、生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制等多角度進(jìn)行科學(xué)論證，合理選擇生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)。生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的建立、檢定與質(zhì)量控制應(yīng)遵循 ICH Q5D、ICH Q5A（R2）及《中國藥典》2025年版三部通則0234“生物制品生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備與質(zhì)量控制”的要求。為提高EVs藥物質(zhì)量的批間一致性，建議對EVs藥物的生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)開展單克隆篩選，并采用多種技術(shù)手段確證細(xì)胞的單克隆性。

  生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的穩(wěn)定性是保障 EVs 藥物質(zhì)量持續(xù)穩(wěn)定的重要基礎(chǔ)。建議參照CH Q5A(R2)和ICH Q5B等相關(guān)要求，開展細(xì)胞傳代過程中的病毒安全性、遺傳穩(wěn)定性等研究，關(guān)注目的組分在傳代過程中的穩(wěn)定性等。鑒于細(xì)胞傳代代次可能影響EVs藥物的質(zhì)量，建議參考ICHQ5D要求初步確定體外限傳代次，評估生產(chǎn)周期內(nèi)細(xì)胞的表型穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性、干細(xì)胞關(guān)鍵特性（如多能性、分化潛能），以及生產(chǎn)EVs藥物能力的穩(wěn)定性等。建議探索建立細(xì)胞庫質(zhì)量與 EVs 藥物關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）的關(guān)聯(lián)評價(jià)策略：除常規(guī)監(jiān)測細(xì)胞活力、倍增時(shí)間、細(xì)胞表型等指標(biāo)外，還建議在設(shè)定的傳代節(jié)點(diǎn)及儲(chǔ)存時(shí)間點(diǎn)，考察所制備EVs藥物的粒徑、純度、生物學(xué)活性等QAs 是否持續(xù)符合預(yù)期要求，為生產(chǎn)工藝的穩(wěn)健性提供充分、科學(xué)的評價(jià)依據(jù)。考慮到不同供者來源的細(xì)胞對 EVs藥物質(zhì)量的影響，建議采用單個(gè)供者來源的細(xì)胞，以保障 EVs藥物批間質(zhì)量一致性；若基于生產(chǎn)需要，確需采用多個(gè)供者來源的細(xì)胞進(jìn)行EVs藥物的生產(chǎn)，應(yīng)對每個(gè)供者來源的細(xì)胞開展充分的研究和評估。如臨床試驗(yàn)期間發(fā)生細(xì)胞供者變更，需開展充分的變更可比性研究以支持變更前后 EVs 藥物的質(zhì)量可比性。

 2.不同類型生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的要求

  如生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)為原代細(xì)胞，對于免疫細(xì)胞等體細(xì)胞，可參考《免疫細(xì)胞產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》開展研究；對于人源干細(xì)胞（如成體干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及其分化細(xì)胞），可參考《人源干細(xì)胞產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》開展研究。如生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)為具有細(xì)胞庫體系的細(xì)胞，應(yīng)明確細(xì)胞的來源、篩選過程等，建議結(jié)合 EVs 的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量研究等內(nèi)容，闡述克隆選擇依據(jù)。經(jīng)體外基因修飾的細(xì)胞，應(yīng)明確基因修飾方法，包括但不限于載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)導(dǎo)方式、克隆篩選過程等。此外，建議基于產(chǎn)品特點(diǎn)開展相應(yīng)研究，如基因修飾效率研究（基因轉(zhuǎn)導(dǎo)/表達(dá)效率等）、基因修飾相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)控制（如，游離核酸/蛋白、致癌元件和具有致瘤能力的細(xì)胞衍生的 EVs等雜質(zhì)）和修飾后細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性研究、基因修飾對細(xì)胞表型和生物學(xué)特性的影響研究、目的基因表達(dá)情況和表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性、裝載效率研究等。如采用病毒載體等對細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，應(yīng)開展細(xì)胞載體整合位點(diǎn)分析及拷貝數(shù)檢測，關(guān)注額外的病毒污染風(fēng)險(xiǎn)，例如由病毒載體引入的風(fēng)險(xiǎn)，以及復(fù)制型病毒污染的可能性。

（二）用于生產(chǎn)EVs藥物的其他原材料和輔料，應(yīng)符合什么要求？

  EVs藥物生產(chǎn)用的原輔料應(yīng)來源清晰。應(yīng)按照《中國藥典》2025年版三部通則0232“生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料的質(zhì)量控制”的要求進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估和控制，以提高藥物安全性并保障藥物質(zhì)量可控。為保障EVs藥物CQAs 持續(xù)穩(wěn)定，有效降低外源因子污染及工藝相關(guān)雜質(zhì)引入風(fēng)險(xiǎn)，EVs藥物生產(chǎn)全過程建議采用無動(dòng)物源成分的細(xì)胞培養(yǎng)體系。原則上應(yīng)避免使用人血小板裂解液等人源生物來源添加組分；如果必需使用，應(yīng)開展充分的研究以證明使用的必要性和用量的合理性，建立完善的風(fēng)險(xiǎn)控制方案，并全面評估其對最終藥物組成、純度、生物學(xué)活性等的潛在影響，必要時(shí)對其攜帶的 Vs 進(jìn)行含量控制或去除。對于培養(yǎng)基中細(xì)胞因子、激素、酶類等功能性添加物，如確需使用，應(yīng)明確其來源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量控制要求（包括純度、雜質(zhì)譜、外源因子等），并優(yōu)先選用非動(dòng)物源的重組表達(dá)原材料；同時(shí)應(yīng)評估該類添加物對 EVs藥物分泌效率、組成特征及功能活性的影響，以及其在最終藥物中的殘留水平與相關(guān)安全風(fēng)險(xiǎn)。采用親和層析、免疫捕獲等工藝進(jìn)行特定 EVs藥物的分離純化時(shí)，所使用的抗體、連接子、配體等親和材料，以及固相基質(zhì)等關(guān)鍵原材料，應(yīng)明確其來源、制備工藝及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。針對細(xì)胞來源物料及動(dòng)物源性抗體，應(yīng)開展病毒安全性檢測及外源因子污染風(fēng)險(xiǎn)評估；并應(yīng)對細(xì)胞、抗體、配體等關(guān)鍵物料引入的細(xì)胞碎片、抗體和（或）配體殘留等工藝相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行檢測與安全性風(fēng)險(xiǎn)評估，必要時(shí)在藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中設(shè)定相應(yīng)殘留可接受限值。用于EVs藥物生產(chǎn)的緩沖液、鹽類、密度梯度介質(zhì)、濾膜、層析填料等原材料，其質(zhì)量水平與適用范圍應(yīng)能夠保證生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性及藥物質(zhì)量的一致性，建議優(yōu)先選用符合現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)或在 GMP條件下生產(chǎn)的物料。此外，在條件允許時(shí)，鼓勵(lì)選用經(jīng)滅菌的一次性分離、純化原材料，采用單批次一次性使用模式，降低因清潔不充分、批次間交叉污染及材料老化等帶來的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，保障生產(chǎn)過程的可控性與穩(wěn)定性。對于裝載活性成分或靶向分子的EVs，其裝載的分子應(yīng)按照臨床試驗(yàn)申報(bào)要求開展相關(guān)藥學(xué)研究，并對裝載工藝過程引入的試劑進(jìn)行殘留檢測或安全性風(fēng)險(xiǎn)評估。

（三）對于EVs藥物的工藝開發(fā)，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注哪些方面？

  EVs藥物的原液生產(chǎn)工藝通常包括上游細(xì)胞培養(yǎng)上清收獲液制備和下游純化兩個(gè)工藝階段。

  EVs藥物上游工藝開發(fā)中，建議研究工藝對細(xì)胞生長性能、產(chǎn)物產(chǎn)量與質(zhì)量的影響，同時(shí)關(guān)注生產(chǎn)過程中EVs藥物CQA的表征研究?？紤]到細(xì)胞培養(yǎng)條件的變化可能顯著影響EVs藥物的表面標(biāo)志物表達(dá)譜、活性成分組成及生物學(xué)活性等質(zhì)量屬性，因此建議參照 ICHQ8 等藥物研發(fā)指南，基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念，開展深入的工藝研究，探索生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的組學(xué)（如轉(zhuǎn)錄組，代謝組）變化與 EVs藥物CQAs的關(guān)聯(lián)。

  工藝研究中，建議關(guān)注細(xì)胞傳代次數(shù)、接種密度、細(xì)胞活力、溫度、pH、溶氧、培養(yǎng)基組成（如血清濃度及血清添加或去除策略）等工藝參數(shù)對 EVs藥物產(chǎn)量及質(zhì)量屬性的潛在影響。在EVs收獲環(huán)節(jié)，若需合并多批次或不同培養(yǎng)階段的上清液，應(yīng)對各批次/各階段細(xì)胞培養(yǎng)過程指標(biāo)（如適用）與收獲液中間體質(zhì)量檢測結(jié)果開展一致性評估，基于評估結(jié)果，合理開展合批操作。對于裝載活性成分或靶向分子的EVs，其上游工藝開發(fā)中需明確裝載工藝步驟和原理，研究裝載工藝參數(shù)與裝載效率的相關(guān)性，評估裝載工藝對EVs結(jié)構(gòu)和功能的影響等。

  針對下游純化工藝開發(fā)，建議充分考量單一分離純化技術(shù)的固有局限性，鼓勵(lì)采用基于不同分離原理的組合式純化工藝，通過多技術(shù)協(xié)同純化，有效提升目標(biāo)EVs藥物的純度與工藝回收率。針對除菌過濾環(huán)節(jié)，需關(guān)注EVs藥物粒徑與常規(guī)濾膜孔徑接近所引發(fā)的濾膜堵塞、顆粒截留及剪切力導(dǎo)致的EVs藥物結(jié)構(gòu)損傷等潛在風(fēng)險(xiǎn)，開展過濾工藝參數(shù)研究。必要時(shí)可采用全密閉生產(chǎn)工藝，結(jié)合基于工藝全過程控制的替代性工藝策略。此外，鑒于EVs藥物的粒徑、膜結(jié)構(gòu)等理化性質(zhì)與病毒等外源因子高度相近，對常規(guī)病毒滅活/去除工藝耐受性較差，下游工藝實(shí)現(xiàn)有效病毒清除有較大挑戰(zhàn)。因此建議遵循源頭控制原則，參照ICH Q5A（R2）等相關(guān)要求，加強(qiáng)對生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)、原材料及全工藝流程的外源因子污染控制，關(guān)注細(xì)胞庫和關(guān)鍵中間體（如未加工收獲液）的檢測控制，并結(jié)合藥物特性開展病毒安全性風(fēng)險(xiǎn)評估。

  制劑工藝開發(fā)應(yīng)保障EVs藥物在貯存、運(yùn)輸及臨床使用 全流程中的物理化學(xué)穩(wěn)定性與生物學(xué)功能穩(wěn)定性。建議基于QbD 理念，系統(tǒng)開展制劑處方研究，選用組分明確、質(zhì)量可控、安全性風(fēng)險(xiǎn)低的輔料種類，并科學(xué)確定其適宜濃度。在處方篩選與優(yōu)化過程中，建議考察EVs藥物濃度、純度、膜完整性、粒徑分布、表面電荷及生物學(xué)活性等 CQAs 的變化趨勢，根據(jù)研究數(shù)據(jù)完善制劑處方，確保臨床試驗(yàn)用樣品的質(zhì)量在貯存、運(yùn)輸和使用過程中穩(wěn)定可控。

（四）臨床試驗(yàn)用EVs藥物質(zhì)量研究的一般要求？

   EVs藥物作為高度復(fù)雜的多組分體系，具有多樣性、異質(zhì)性、復(fù)雜性等特點(diǎn)，在質(zhì)量研究中應(yīng)遵循基于風(fēng)險(xiǎn)、科學(xué)合理原則。在臨床試驗(yàn)申報(bào)階段，建議根據(jù)EVs藥物質(zhì)量特性，基于成分分析、理化性質(zhì)、純度與雜質(zhì)、生物學(xué)活性及微生物安全性等方面進(jìn)行研究，并結(jié)合非臨床與臨床研究數(shù)據(jù)初步確認(rèn)關(guān)鍵質(zhì)量屬性?；贓Vs藥物的特點(diǎn)和現(xiàn)有的檢測技術(shù)發(fā)展情況，建議采用具有不同原理的正交方法開展質(zhì)量研究，在質(zhì)量研究中納入具有工藝代表性的非臨床研究樣品、臨床試驗(yàn)樣品，并鼓勵(lì)采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行批間一致性的分析。質(zhì)量研究采用的研究方法應(yīng)提供選擇依據(jù)和詳細(xì)的方法描述，如樣品處理、關(guān)鍵參數(shù)設(shè)置、數(shù)據(jù)處理等，必要時(shí)應(yīng)提供方法開發(fā)和優(yōu)化的相關(guān)資料。

  成分分析：考慮到EVs 藥物組分較為復(fù)雜，并可能分布于EVs藥物表面和內(nèi)部，在臨床試驗(yàn)申報(bào)階段建議采用先進(jìn)的、靈敏的技術(shù)手段，如液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）、RNA 測序（RNA-seq）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）等，對 EVs藥物存在的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等相關(guān)分子進(jìn)行系統(tǒng)定性與半定量/定量表征。應(yīng)關(guān)注工藝相關(guān)雜質(zhì)對成分分析檢測結(jié)果的影響，必要時(shí)采取適當(dāng)?shù)那疤幚矸椒ㄟM(jìn)行EVs的濃縮或雜質(zhì)去除。基于現(xiàn)有科學(xué)認(rèn)知，目前尚無適用于所有EV 藥物亞群的通用標(biāo)志物，四跨膜蛋白(如CD9，CD63和CD81)和晚期內(nèi)體相關(guān)蛋白(如 TSG101和 Alix)是 EVs 藥物研究中常用的標(biāo)志物，鼓勵(lì)基于早期質(zhì)量研究初步探索藥物特異性標(biāo)志物，開展半定量/定量分析，同時(shí)對非囊泡相關(guān)成分進(jìn)行半定量/定量分析。鼓勵(lì)采用納米流式等高分辨率單顆粒分析技術(shù)對囊泡亞群異質(zhì)性進(jìn)行表征，為工藝優(yōu)化和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

  理化特性分析：通常包括EVs藥物形態(tài)結(jié)構(gòu)、粒徑分布、顆粒濃度及表面電荷等研究。囊泡形態(tài)方面，建議采用高分辨率圖像分析方式（如冷凍電鏡、透射電鏡等）進(jìn)行研究和確證。膜結(jié)構(gòu)完整性可考慮采用納米流式等方法開展研究。顆粒濃度通?？紤]作為劑量指標(biāo)納入關(guān)鍵質(zhì)量屬性，根據(jù)樣品粒徑范圍和檢測方法的特點(diǎn)可考慮采用多種不同原理的檢測方法進(jìn)行正交檢測。

  純度與雜質(zhì)研究：由于EVs藥物的組分復(fù)雜，較難在單一維度層面定義其純度，建議通過目標(biāo)顆粒占比、特征標(biāo)志物和雜質(zhì)水平等指標(biāo)綜合描述。常用的純度指標(biāo)包含顆粒數(shù)/總蛋白、完整顆粒/總顆粒數(shù)、功能性顆粒/總顆粒比值、目標(biāo)分子的修飾效率、包封率、載藥率等。雜質(zhì)研究一般考慮藥物相關(guān)雜質(zhì)和工藝相關(guān)雜質(zhì)的識別和定量。其中，藥物相關(guān)雜質(zhì)通常包括結(jié)構(gòu)異常囊泡、不完整結(jié)構(gòu)囊泡、降解囊泡、游離的目標(biāo)分子等。工藝相關(guān)雜質(zhì)包括非EVs 相關(guān)蛋白/核酸、來源于宿主細(xì)胞的高風(fēng)險(xiǎn)基因片段（如，HEK293細(xì)胞的E1A和SV40等）、細(xì)胞碎片/細(xì)胞器等和工藝引入雜質(zhì)，包括培養(yǎng)體系添加物（如血清、重組蛋白、抗生素、微載體等）、層析介質(zhì)配體、關(guān)鍵原材料引入的雜質(zhì)等。對于非EVs相關(guān)蛋白/核酸的檢測方法，如選用特定分子作為檢測靶標(biāo)應(yīng)提供選擇依據(jù)。同時(shí)建議積累非EVs 相關(guān)DNA的片段大小檢測數(shù)據(jù)和高風(fēng)險(xiǎn)基因片段的拷貝數(shù)等。

  生物學(xué)活性分析：目前部分EVs藥物活性成分復(fù)雜，可能具有多重作用機(jī)制，如細(xì)胞增殖與遷移、凋亡調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、抗炎活性、組織修復(fù)相關(guān)信號通路活化等，鼓勵(lì)在早期研究階段多方位探索產(chǎn)品的潛在作用機(jī)制，并基于EVs 適應(yīng)癥相應(yīng)的作用機(jī)制，嘗試建立多維度的檢測體系，以充分描述其生物學(xué)活性特征，在研發(fā)早期盡可能的積累相關(guān)數(shù)據(jù)。對于裝載分子明確，作用機(jī)制清晰的EVs，應(yīng)基于其藥物設(shè)計(jì)和作用機(jī)制開展相關(guān)的生物學(xué)活性分析，初步確立量效關(guān)系，同時(shí)建議關(guān)注裝載分子本身的活性以及裝載完成后完整EVs的生物學(xué)活性。

  安全性分析：本文件中的安全性主要是指微生物污染和微生物代謝產(chǎn)物污染的研究，包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒、內(nèi)毒素等。應(yīng)遵循風(fēng)險(xiǎn)評估、全過程控制的原則，對細(xì)胞基質(zhì)和原輔材料中潛在的外源因子進(jìn)行全面檢定和控制，生產(chǎn)過程采用合理的措施避免引入外源因子。同時(shí)，在工藝過程的適當(dāng)步驟、原液和制劑階段開展細(xì)菌內(nèi)毒素、支原體、微生物限度/無菌檢測等。

（五）EVs藥物的顆粒濃度和粒徑表征研究應(yīng)如何開展？ 

  鑒于EVs藥物自身的異質(zhì)性和工藝的局限性，臨床試驗(yàn)批次樣品的粒徑分布可能較寬。目前，常用于EVs 顆粒濃度和粒徑分布檢測的方法包括納米顆粒跟蹤分析（NTA）、納米流式細(xì)胞術(shù)（nanoFCM）、電阻脈沖傳感（如納米庫爾特粒度儀）等。由于不同檢測方法的原理存在差異，建議關(guān)注這些差異可能帶來的影響，例如對小尺寸顆粒的低估、顆粒聚集現(xiàn)象，或共分離雜質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾。根據(jù)目標(biāo)藥物的粒徑分布特點(diǎn)，選擇合適的檢測方法；必要時(shí)，可采用正交方法進(jìn)行交叉驗(yàn)證，并結(jié)合方法學(xué)對比研究及歷史批次數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的接受標(biāo)準(zhǔn)。在檢測過程中，應(yīng)關(guān)注稀釋、濃縮、染色等樣品處理操作對EVs藥物質(zhì)量屬性的潛在影響，合理設(shè)置對照組，并對所采用的方法開展適用性評估。方法確定后，建議固定關(guān)鍵的測量參數(shù)以確保結(jié)果的可比性。由于 EVs 粒徑分布可能較寬，除報(bào)告平均粒徑、粒徑中位數(shù)外，還建議關(guān)注樣品中不同大小顆粒的分布及其變化趨勢，如 D10、D50、D90 等參數(shù)在批次間的變化情況。

（六）生物學(xué)活性應(yīng)如何開展研究？

  生物學(xué)活性是對藥物的特性、質(zhì)量以及批間一致性進(jìn)行研究和評價(jià)的重要指標(biāo)。一般而言，生物學(xué)活性檢測方法的設(shè)計(jì)應(yīng)盡可能反映樣品的臨床作用機(jī)制。然而，由于EVs 在理化性質(zhì)、組成成分等方面具有異質(zhì)性，同時(shí)部分EVs 作用機(jī)制較為復(fù)雜，鼓勵(lì)申請人在早期研究階段盡可能全面地探索藥物的潛在作用機(jī)制，并建立多維度的檢測體系，以系統(tǒng)描述其生物學(xué)活性特征。在方法構(gòu)建過程中，可綜合運(yùn)用多種技術(shù)手段進(jìn)行多維度評價(jià)，例如：基于生化原理的活性檢測、基于細(xì)胞的生物學(xué)活性檢測等。為進(jìn)一步提升活性指標(biāo)的特異性，可考慮基于顆粒數(shù)量等指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，從而初步表征EVs藥物的特異性的生物活性。在方法開發(fā)過程中，建議關(guān)注劑量-反應(yīng)關(guān)系的建立、動(dòng)物種屬選擇的相關(guān)性等因素，并合理設(shè)置對照組，如采用合理 EVs陰性對照（如失活EVs、培養(yǎng)體系引入的EVs等）以排除背景信號及共分離成分的干擾。建議在開展臨床試驗(yàn)申請前完成方法學(xué)的初步驗(yàn)證，以確保檢測結(jié)果的可靠性、重復(fù)性和科學(xué)性。

   對于裝載的活性成分或靶向分子較為明確的EVs，建議關(guān)注裝載分子本身以及裝載完成后EVs的生物學(xué)活性，如裝載的目的基因的序列分析，表達(dá)產(chǎn)物的分析和目的基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性研究等；靶向分子與受體的結(jié)合活性、親和力等；完整EVs與靶細(xì)胞的識別、膜融合、活性分子相應(yīng)的生物學(xué)功能等。

（七）臨床試驗(yàn)階段EVs藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制項(xiàng)目的一般要求？

  EVs藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定可參考ICHQ6B的基本原則，同時(shí)結(jié)合EVs固有特點(diǎn)、藥物給藥途徑、生產(chǎn)工藝能力、質(zhì)量研究數(shù)據(jù)、非臨床及臨床研究結(jié)果綜合評估，核心目的是保證藥物的安全性、有效性及質(zhì)量批間一致性。在臨床試驗(yàn)申報(bào)階段，EVs藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目建議考慮以下指標(biāo)：形態(tài)、粒徑及其分布（應(yīng)報(bào)告分布參數(shù)）、含量/顆粒數(shù)、鑒別（標(biāo)志物）、純度（顆粒蛋白比例、完整顆粒比、目標(biāo)顆粒比等）、生物學(xué)活性、藥物和工藝相關(guān)雜質(zhì)、微生物安全性（無菌、內(nèi)毒素、支原體、外源病毒（如適用））、一般檢測（外觀、pH值、可見異物、滲透壓摩爾濃度、裝量）等。在制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，建議對所選檢測方法的科學(xué)性和適用性予以適當(dāng)說明。針對粒徑及顆粒數(shù)等關(guān)鍵質(zhì)量屬性，建議采用多維度互補(bǔ)檢測方式進(jìn)行檢測，避免過度依賴單一分析平臺(tái)。隨著臨床研究的推進(jìn)、對藥物特性研究的不斷深入、生產(chǎn)工藝的優(yōu)化及檢測技術(shù)的進(jìn)步，持續(xù)完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

（八）臨床試驗(yàn)階段，EVs藥物穩(wěn)定性研究的一般考慮？

  穩(wěn)定性研究內(nèi)容一般應(yīng)包括影響因素試驗(yàn)（如適用）、加速試驗(yàn)、長期試驗(yàn)、運(yùn)輸試驗(yàn)及臨床使用中穩(wěn)定性試驗(yàn)。試驗(yàn)樣品應(yīng)涵蓋代表性原液及制劑，其生產(chǎn)過程和質(zhì)量屬性應(yīng)能代表實(shí)際臨床試驗(yàn)用樣品的生產(chǎn)情況。除一般研究內(nèi)容外，穩(wěn)定性研究還建議結(jié)合制劑處方研究、制劑工藝開發(fā)和臨床給藥方式等進(jìn)行針對性設(shè)計(jì)。

一方面，可通過穩(wěn)定性研究對比不同緩沖體系和冷凍保護(hù)劑對EVs藥物的保護(hù)效果，為制劑處方優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持；另一方面，若藥物臨床使用前需進(jìn)行稀釋等操作，必須評估使用期間EVs藥物在相關(guān)介質(zhì)中的粒徑、完整性及活性維持情況 確保臨床給藥窗口期的安全有效。

在穩(wěn)定性試驗(yàn)條件設(shè)置上，需充分考慮EVs藥物質(zhì)量特性和敏感的考察指標(biāo)。例如，影響因素試驗(yàn)可重點(diǎn)考察高溫、光照、劇烈振蕩及反復(fù)凍融對EVs藥物粒徑、膜完整性及功能活性的影響。加速試驗(yàn)應(yīng)充分考慮EVs藥物脂質(zhì)結(jié)構(gòu)在特定溫度條件下可能發(fā)生的物理狀態(tài)改變（如膜完整性變化、EVs 顆粒的膜融合等），這些變化可能顯著影響EVs藥物的結(jié)構(gòu)完整性。

對于凍干制劑，還應(yīng)評估復(fù)溶后的穩(wěn)定性。此外，運(yùn)輸試驗(yàn)應(yīng)模擬實(shí)際振動(dòng)強(qiáng)度，臨床使用中穩(wěn)定性則需評估EVs藥物與輸液容器、稀釋液配伍后的放置時(shí)限及相容性。由于EVs藥物潛在的作用機(jī)制復(fù)雜，基于不同的臨床適應(yīng)癥，其制劑類型也復(fù)雜多樣，不同制劑類型在穩(wěn)定性考察時(shí)應(yīng)同時(shí)結(jié)合臨床應(yīng)用場景合理設(shè)置考察條件。穩(wěn)定性考察項(xiàng)目的選擇應(yīng)結(jié)合品種特點(diǎn)，質(zhì)量屬性與臨床安全性有效性的相關(guān)性，采用正交分析方法全面監(jiān)測質(zhì)量變化。理化穩(wěn)定性方面，通常需關(guān)注顆粒數(shù)、粒徑分布、聚集趨勢、膜完整性及表面電荷變化，這些指標(biāo)可在一定程度上反映EVs藥物的囊泡結(jié)構(gòu)完整性和均一性。此外，應(yīng)考慮功能性輔料在保存期間的變化是否可能破壞EVs藥物結(jié)構(gòu)并影響藥物活性。生物學(xué)穩(wěn)定性方面，盡可能追蹤效價(jià)標(biāo)志物含量及生物學(xué)活性，確保藥物功能成分在儲(chǔ)存期內(nèi)不丟失，同時(shí)監(jiān)測純度及微生物安全性指標(biāo)，保障臨床用藥安全。

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