CHO 細(xì)胞表達(dá)的水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus, VZV)糖蛋白 E (VZV gE) 降低了因糖基化差異發(fā)生人體免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn);同時(shí)， CHO 細(xì)胞能夠整合外源基因，利于外源蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與傳統(tǒng)的微生物細(xì)胞相比難度較大，主要是由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞倍增時(shí)間長(zhǎng)、代謝途徑復(fù)雜、對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，目前常用的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞培養(yǎng)方式主要分為流加培養(yǎng)、批次培養(yǎng)、以及灌流培養(yǎng)。大多數(shù)生物醫(yī)藥分子是不穩(wěn)定的，在流加培養(yǎng)和批次培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物和釋放的酶，以及滲透壓的增加都不利于細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)。灌流培養(yǎng)可以不斷地輸出代謝副產(chǎn)物，輸入新鮮培養(yǎng)基，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供一個(gè)穩(wěn)定環(huán)境，降低產(chǎn)物在培養(yǎng)基中的停留時(shí)間，有利于提高產(chǎn)品質(zhì)量。YANG 等研究表明，灌流培養(yǎng)有望在產(chǎn)能上實(shí)現(xiàn)小型生產(chǎn)設(shè)備取代大型生產(chǎn)設(shè)備的目標(biāo)。因此，對(duì)灌流培養(yǎng)工藝的開發(fā)與優(yōu)化成為哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝研究的熱點(diǎn)，F(xiàn)DA 也鼓勵(lì)生物制藥生產(chǎn)工藝由傳統(tǒng)批次培養(yǎng)轉(zhuǎn)型到灌流培養(yǎng)。灌流培養(yǎng)主要受以下幾個(gè)關(guān)鍵因素影響：培養(yǎng)溫度、pH、灌流速度等。調(diào)節(jié)好培養(yǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵因素，可以大大提高灌流培養(yǎng)的細(xì)胞密度和蛋白表達(dá)量。

實(shí)驗(yàn)方法與材料詳見(jiàn)

莊宗蘭，程杰，彭杰，周云，祁碧玉，楊文靜，楊世龍，譚小東.超聲截留 

灌流培養(yǎng)重組 CHO 細(xì)胞工藝優(yōu)化[J/OL].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展 https://kns.cnki.net/kcms/detail/62.1120.R.20220513.1813.008.html

值得借鑒的方法

響應(yīng)面分析

Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用 Design experts 8.0 軟件擬合數(shù)據(jù)，然后對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)求解得到最佳培養(yǎng)條件為：灌流培養(yǎng)溫度 33.2 °C，pH 7.0，灌流速度 4.1 mL/min。

過(guò)程參數(shù)監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)變化

3 批驗(yàn)證結(jié)果顯示，相較批培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng) 5~7 d，收獲體積增加 5~7 倍。從培養(yǎng) 1 d 開始，對(duì) 3 組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞每天取樣，檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖和乳酸含量變 化，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)體系中的葡萄糖含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，從初始的約 6 g/L 降低至 2 g/L。由于細(xì)胞代謝的作用培養(yǎng)液中乳酸含量不斷累加，從 0.1 g/L 升高至 1.9 g/L，葡萄糖和乳酸含量變化趨勢(shì)，見(jiàn)圖 2。

細(xì)胞密度從培養(yǎng) 3 d 開始進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，7 d 進(jìn)入平臺(tái)期，最高細(xì)胞 密度達(dá)到 1.6×107/mL。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和代謝物質(zhì)的累加，細(xì)胞活性逐漸下降，培養(yǎng)至 13 d 時(shí)細(xì)胞活 性低于 80%，停止培養(yǎng)，見(jiàn)圖 3。 

結(jié)論

本研究對(duì) CHO 細(xì)胞的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，利用已優(yōu)化的培養(yǎng)條件進(jìn)行 3 批灌流培養(yǎng)重組 CHO 細(xì)胞表 達(dá) VZV gE 蛋白。灌流培養(yǎng)與批次培養(yǎng)相對(duì)分子質(zhì)量一致，且發(fā)生糖基化修飾。

   在灌流培養(yǎng)后期，降低培養(yǎng) 溫度，重組 CHO 細(xì)胞活率相較于 37 °C條件下提高了約 20%，gE 蛋白表達(dá)量提高了約 2 倍。與批培養(yǎng)相比， 灌流培養(yǎng)的時(shí)間延長(zhǎng)了 5~7 d，收獲體積增加了 5~7 倍。影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的因素很多，包括葡萄糖含量、乳酸含量、溫度、灌流速度、pH 等。

     葡萄糖作為細(xì)胞代謝過(guò)程中最重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞生長(zhǎng)所需碳源，不論是在批次培養(yǎng)還是流加培養(yǎng)過(guò)程中，都是重要的考量因素。

在批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)過(guò)程中過(guò)高的葡萄糖濃度會(huì)導(dǎo)致高乳酸濃度的積累，從而不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)及表達(dá)。在灌流培養(yǎng)過(guò)程中，為了更高效地利用培養(yǎng)基，可以通過(guò)降低灌流速率的同時(shí)提高培養(yǎng)基中起始葡萄糖濃度，既保證細(xì)胞代謝過(guò)程中能量及碳源的充足，又提高培養(yǎng)基的利用率及降低生產(chǎn)成本。因?yàn)楣嗔髋囵B(yǎng)過(guò)程中代謝副產(chǎn)物(如乳酸)不斷被帶出，濃度不斷被稀釋，一定高濃度的葡萄糖可能并不導(dǎo)致其代謝副產(chǎn)物有較高的累積，故培養(yǎng)液中葡萄糖濃度可被列為灌流培養(yǎng)工藝開發(fā)過(guò)程中一個(gè)重要的考量因素。